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Fluorscence sensing of active biomolecules

특정 Metal Ion들은 생체 내에서, 혹은 자연적인 환경 내에서 독성 물질로 작용한다. 예를 들어 수은, 납 등이 생물체의 내에 축적되었을 경우, 독성이 발현되어 병의 원인으로 작용할 수 있다. 또한 은 나노 입자 (Ag Nanoparticle)의 경우는 수생 환경에서 DNA 복제를 억제하고 세포질 막 교란, Enzyme의 비활성 등 여러가지 문제를 야기할 수 있다. 따라서 최근 이러한 Metal Ion들을 Sensing할 수 있는 Sensor의 개발이 요구되었다.

독성 물질로 작용할 수 있는 Metal Ion들을 검출하기 위한 다양한 peptide 기반의 Fluorescence Sensor를 개발하였다. 뿐만 아니라 독성을 가지고 있는 다른 Metal Ion들을 검출하기 위하여 새로운 Sensor들이 연구 중에 있다. 이러한 연구들을 통해 Environmental metal detection 비례 형광 센서를 개발하는 것을 목표로 한다.이를 위해 Sensor를 Modify함으로써 특정한 Metal만의 반응을 나타내는 Sensor를 연구 중에 있다. 이를 통해 특정 Metal의 정량 및 분석을 할 수 있는 Sensor의 개발에 박차를 가하고 있다.

1. Heparine, Heparan Sulfate (HS)

Heparan sulfate (HS)와 Heparin은 glycosaminoglycans의 일종으로, 음전하를 띈 선형의 형태의 polysaccharide이다. 그 중에서도 Heparan sulfate(HS)는 세포 내 다양한 역할을 수행하며, 세포 노화의 척도로도 사용한다.

본 랩실에서는 Pyrene-cyano 형광체를 사용한 펩타이드 기반의 Ratiometric fluorescence probe를 개발, 특히 아르지닌 시퀀스를 도입한 Sensor의 합성에 성공하였고, 이는 곧 Serum 조건 하에서도 Ratiometric한 형광 변화를 보여주는 효과적인 Sensor임을 확인하였다. 이렇게 개발한 HS Sesnor는 선택성, 생체 적합성 등에서 뛰어난 성능을 보였으며, 이를 정리하여 관련 논문을 2023년, 저널 Biosensors and Bioelectronics에 발표하였다.

2. H2O2

세포 내 신호 전달 중요 물질인 H2O2 를 모니터링 하는 것은 건강 상태의 척도로 쓰일 수 있는데, 이를 위해 본 랩실에서는 그동안 사용해왔지만 한계가 있는 보로닉 산을 대신한 새로운 작용 그룹의 H2O2 센서를 개발하였고, 이 Sensor는 Ratiometric 형광변화 및 살아있는 세포에서의 형광 이미지 변화 모니터링이 가능하였다

3. Glucose

D-Glucose, 즉 포도당은 유기체의 가장 중요한 에너지원이다. 암세포에는 비정상적인 Glucose가 축적되어 이를 검사하는 Sensor의 중요성이 대두되었다.

그동안 있었던 sensor를 개량하여 다양한 pH의 범위 및 장파장에서의 측정에 성공하였으며 ratiometric하게 형광이 변화하였다. 현재 시점에서는 선택성을 증가시키기 위한 여러가지 방안을 모색하고 있다.

4. Zinc Ion

아연 이온은 인체에서 두 번째로 풍부한 전이 금속 이온이며 수많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다. Zn2+ 이온의 불균형은 여러 신경학적 장애와 강하게 연관되어 있다. 따라서 Zn2+ 이온을 선택적이고 민감하게 감지할 수 있는 방법을 설계하고 개발할 필요가 있었다.

본 랩실에서는 수용액에서 Zn2+의 비례형 검출 Sensor를 개발하였다. 두 개의 이미다졸 및 두 개의 술폰아미드 그룹을 포함하고 있는 이 Sensor는 상기의 두 Group이 Zn2+와의 결합에서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌습니다. 이 Peptide Prboe는 성공적으로 세포 내로 침투하여 생체 내 Zn2+를 감지하으며, 이를 Sensors and Actuators B: Chemical에 발표하였다.

5. Cooper Ion

구리는 여러 종류의 구리효소 활성 부위에서 산화 환원 공동인자로서 생물체에서 필수적인 역할을 담당한다. 한편, 이 산화 환원 특성은 DNA, 단백질 및 지질에 대한 산화적 손상과 같은 본질적인 독성을 유발한다. 따라서, 구리 관련 병리 메커니즘과 질병을 조사하기 위해 생세포 내 골지체에서 Cu+를 모니터링하는 것이 중요하다.

본 랩실에서 개발한 Cooper Sensor는 Peptide 수용체의 Thiol기가 Cu+와의 강력한 결합에 중요한 역할을 하며, 프로브의 sulfonamide group과 amide group이 Cu+와 복합체를 형성하기 하는데 도움을 준다. 이형광 펩티드 기반 프로브는 세포 내로 침투하고 살아 있는 세포 내에서 골지체에서 Cu+를 턴온 응답으로 성공적으로 감지했으며, 이를 2016년 Biosensors and Bioelectronics에서 발표하였다.

Nanoenzyme

생체 내에 존재하는 효소는 그 종류가 다양하며 각 효소들은 각자의 고유한 촉매 활성을 가지고 있다. 이러한 효소들은 생체 내 환경이 아닌, 외부 환경에서 3차원 구조가 무너지게 되며, 이로 인해 효소가 가지고 있는 촉매 활성이 없어진다는 한계점이 존재한다. 실제 효소가 가지고 있는 이러한 문제를 해결하기 위한 방법으로 생체내 효소의 active site를 모방한 peptide기반의 Supramolecular nanozymes에 대한 연구가 진행되고 있다.

Inorganic nano particle의 경우 낮은 생산 단가, 손쉬운 사용 준비까지 다양한 방면에서 기존 효소보다 green-life industry에서 사용되기 적합하지만, 낮은 선택성과 촉매활성으로 인한 불안정성이 한계로 지목되어지고 있다. Nanozyme의 경우에는 주로 Peptide(실제 효소의 active site 모방)의 자가 조립을 통해 실제 효소가 갖는 촉매 활성을 보여준다. Nanozyme은 기존 효소와 달리 범용성 있는 기질 특이성을 통해 다양한 촉매 활성을 나타낼 뿐 아니라 생체 외 환경에서도 높은 안정성을 바탕으로 구조의 변화에 의한 촉매 활성 저하와 같은 문제점을 보이지 않는다는 장점이 있다. 이러한 장점들에 의해 Supramolecular nanozymes는 기존 Enzyme을 생체 외 환경에서 대체할 수 있는 유망한 대안이라 여겨지고 있다.

앞서 설명한 대부분의 nanozyme의 경우 nanozyme이 가지고 있는 peptide 자가 조립능력을 기반으로 supramolecule을 형성하여 촉매 활성 및 효소 활성을 나타낸다. 다시 말해 대부분의 nanozyme은 촉매 및 효소 활성을 보이기 위해서는 자가조립의 형성이 우선적으로 필요하다. 하지만 현재 우리 생유기화학연구실에서는 기존의 nanozyme의 불필요한 자가 조립 과정을 생략, minimal peptide와 metal간의 결합(binding)을 통한 metal complex를 활용하여 촉매 및 효소 활성을 나타내는 Minimal peptide nanozyme(MPN) 합성, 연구를 진행하고 있다. 현재 MPN의 경우 강한 산화 촉매 활성을 보이기 때문에 glutathione oxidase, laccase, lytic polysaccharide monooxygenase(LPMO)등 다양한 효소와의 촉매 및 효소 활성을 비교, 환경 적용 가능성 유무 등 여러 방면으로 연구를 진행하고 있다.

1. GPx(glutathione peroxidase) or glutathione oxidase mimic Nanozyme

GPx는 과산화수소(H2O2)와 유기수산화물을 각각 물(H2O)과 알코올로 환원시켜 항산화 방어에 중요한 역할을 하는 효소이다. 즉, 세포 손상의 원인이 될 수 있는 활성산소종(ROS)과 지질 과산화물의 축적을 막아 주변 세포가 받을 수 있는 산화 스트레스를 최소화하는 역할을 담당한다. GPx를 모방한 Nanozyme은 Gpx와 같이 Oxidization Stress에 대항하는 강력한 항산화 촉매로서 작용하는 것이 가능하며 cytoprotection, anti-inflammation, neuroprotection, tumor therapy, anti-aging등 다양한 분야에서 활용 가능성이 높다. 이러한 GPx 모방 Nanozyme의 경우 아직 사용 가능성 여부가 충분히 검토되지 않았기 때문에 차후 개선 및 개발가능성 또한 높으며, 잠재력 또한 뛰어나기 때문에 연구 가치가 매우 높은 nanozyme이다.

현재 연구중인 MPN의 경우 glutathione oxidase와 같은 촉매 활성을 보여주기 때문에 GPx보다는 glutathione oxidase(GO)와 더 근접하다고 말할 수 있다. GO의 경우 산소를 사용하여 GSH를 산화 시키는 역할을 담당하기 때문에 GPx와는 다르게 세포에 가해지는 산화 스트레스를 가중시킨다. 따라서 GPx와는 다른 분야에서 활용 가능하다. 우리는 GO mimic nanozyme을 통해 cacer cell 내부에서 생성되는 ROS의 제거 과정 억제를 통해 Cancer cell의 ROS 농도를 증가시켜 세포 사멸을 유도 가능성을 토대로 연구를 진행하고 있다.

2. Laccase mimic nanozyme

Laccase는 다중 구리 산화효소의 구성원으로 환경 촉매 및 생화학 산업에서 촉매로 사용되어지고 있다. Laccase는 페놀성 화합물, 방향족 아민 및 리그닌을 포함하는 광범위한 기질의 산화를 촉매하기 때문에 환경에 직접 노출되었을 경우 환경 오염으로 직결되는 클로로페놀 및 비스페놀과 같은 페놀성 오염물질의 분해에 중요한 역할을 한다. 하지만 laccase 또한 기타 여러 생체 내 효소들과 마찬가지로 3차원구조를 통한 촉매 활성을 기반으로 하고 있기 때문에 실제 생체 외부 환경에서 나타내는 페놀성 오염물질에 대한 촉매활성은 떨어지게 된다는 명확한 한계가 존재한다.

Laccase를 모방하는 nanozyme들 중 metal-peptide complex를 활용하여 생체 외 환경에서도 laccase와 준하는 촉매 활성을 보여주는 nanozyme이 존재한다. 이러한 nanozyme들은 생체 외 환경에서 높은 안정성, 재활용성, 뛰어난 기질 보편성으로 인해 기존 laccase보다 생체 외 환경에 적용하기에 굉장히 용이하다. 하지만 이런 nanozyme들 또한 metal-peptide binding을 통한 nanoparticle(Supramolecular nanozymes)형태를 통해서만 촉매 활성을 가지게 된다.

현재 연구 진행중인 Minimal peptide nanozyme(MPN)의 경우 metal(Cu(II)) – peptide complex만을 통해, 페놀성 화합물에 대한 촉매 활성을 보여주고 있으며, 보다 정확한 촉매활성 및 기질 특이성(선택성), 실제 외부 환경에서의 사용 여부에 대해 연구를 진행할 계획이다.

3. LPMO cellulose mimic nanozyme

LPMO(Lytic polysaccharide monooxygenases)는 cellulose 및 여러 다당류가 가지고 있는 glycoside 결합의 산화적 절단을 촉매 하는 효소로서 촉매 활성을 위한 보조 인자로 Cu이온을 필요로 한다. LPMO는 O2 또는 H2O2 및 전자 공여체의 존재 하에서 다당류의 β-1,4-glycoside 결합을 절단하지만 LPMO의 분자 메커니즘, 특히 단백질 환경에서의 산소 활성화 및 glycoside 결합 절단을 위한 Cu 보조 인자를 어떻게 제어하는지에 대해서는 아직도 심도 있는 연구가 진행 중이다.

LPMO의 복합 탄수화물을 단당류 분해하는 능력으로 현재 발전 중인 신재생 에너지원 자원 분야 중 하나인 바이오 연료 및 바이오 정제 산업에서 현재 큰 주목을 받고 있다. 현재 연구 MPN의 경우, LPMO와 마찬가지로 Cu(metal)의 존재 하에서 촉매 활성을 보이며, 강력한 산화 촉매로서 작용한다. LPMO와 같은 다당류의 glycoside 결합의 분해 촉매 활성이 확인되지 않았지만 MPN이 가지고 있는 촉매활성 특성상 glycoside 결합을 분해하는 촉매 활성을 갖을 가능성이 매우 높은 상태이다. 성공적으로 MPN이 LPMO와 같은 촉매 활성을 갖을 경우 이를 통해 바이오 에너지 산업에 큰 발전 이룩할 수 있기 때문에 현재 LPMO mimic nanozyme에 대한 연구에 박차를 가하고 있다.

MPN(Minimal peptide nanozyme)의 경우 정확한 촉매 활성의 확인 및 선택성을 확인하는 연구가 필요하며, 앞서 설명한 3개 효소 이외의 다양한 효소들 과의 촉매활성을 비교하는 연구를 진행할 계획이다. 또한 한 계통의 효소 및 촉매 활성 능력에 국한되지 않고 더 나아가 다양한 활성을 가지는 MPN에 대한 연구를 통해 MPN의 사용 가능 분야를 넓히고, 이후 MPN의 실용성 판단을 통한 실제 외부 환경에 실적용 하는 것이 현재 우리가 진행하고 있는 MPN연구의 최종 목표이다.

사람의 몸속(생체 내)에는 여러가지 역할을 담당하는 다양한 생체 분자들이 존재한다. 생체 분자들은 생체 내 신호를 전달하는 물질로 사용되기도 하며, 세포의 발생과 성장, 소화나 대사와 같은 생화학적 반응의 촉진, 외부 병원체로부터 몸을 지키는 면역 과정 등에서 다양한 역할을 담당한다. 우리가 생체 내에 존재하는 여러 생체 분자들을 검출하고자 하는 이유는 바로 각 생체 분자들은 세포내(상태)를 이해하는데 중요한 biomarker로써 활용될 수 있기 때문이다.

biomarker로써 작용하는 다양한 생체 분자를 검출하기 위해 peptide기반의 fluorescence probe(sensor)를 합성하여 다양한 형광변화를 통해 생체 분자를 인식 및 실시간 정량하는 연구를 진행하고 있다. 더 나아가 실제 동물 모델등에서 센싱 시스템의 적용 및 추후 의약품으로 개발하기 위해 인하대 의대 medical research center와 협업을 진행하여, 실제 동물 세포 및 동물 모델에서 probe(sensor)가 어떻게 작동하는지 확인하는 등 다양한 연구 활동을 통해 연구의 깊이를 더해 나가는 중이다

Environmental Metal Detection Sensor

1. Hg, MeHg

수은은 무기수은과 유기 수은으로 나눌 수 있으며 일반적으로 유기 수은의 독성이 매우 높다. 이 중 메틸 수은은 세포막을 쉽게 투과하며 다양한 조직에 축적되어 강한 독성을 보이지만 이를 인식하는 수용체나 반응이 드물다. 이런 이유로 개발된 대부분의 형광 센서는 메틸 수은에 대해서는 감도가 떨어지거나 검출시간이 느린 단점을 보인다.

우리는 이러한 단점을 극복하기 위하여 fluorescence sensor를 합성하고, ionic detergent와 non-ioinic detergent 존재 하에서 메틸 수은에 대한 형광 거동을 연구하였다. 이 경우, TX-100 마이셀 조건에서 메틸 수은과 수은을 다른 형광 거동으로 인식한다. (메틸 수은 형광 증가형; 수은 형광 이동) CTAB 마이셀에는 메틸 수은 만을 선택적으로 인식하며 메틸 수은의 검출 시간의 경우, 30초 이내로 매우 빠르게 진행되어 관련 센서들과 다르게 세포내에서 매우 민감한 감도로 메틸 수은을 인식할 수 있음을 발견하여 이에 대한 논문을 Sensors & Actuators: B. Chem 및 analytical Chem에 발표하였다.

지질막이 없는 조건에서 작동하는 AIE형광체 기반 메틸 수은 센서의 경우, 뛰어난 검출 능력을 보여주어 관련 내용을 Dyes and Pigments 2022 110461에 발표하ㅌ였다. 또한 개발된 유기 수은 인식 펩타이드 수용체를 benzothiazolylcyanovinylene 형광체에 도입하여 메틸 수은 비례 형광 센서 개발 연구를 진행하였다. 이 경우 기존의 펩타이드 수용체에 self-assembly 능력이 우수한 Trp과 Phe아미노산을 도입하여 수용액에서 메틸 수은을 비례 형광 거동으로 보이는 형광 센서를 개발하여 관련 내용을 analytical method에 발표하였다.

2. Pb(II)

납이온(Pb2+)은 인간 건강에 매우 유해한 물질로 잘 알려져 있다. 납이온은 납이온 자체가 가지는 독성도 위험하지만 다양한 경로를 통해 신체에 노출된다는 것이 가장 무서운 점이다. 납이온에 신체가 노출될 경우 혈액생성기관, 신장, 간 및 기타 장기에 영향을 끼쳐 `여러 생리학적 문제를 야기할 뿐 아니라 납이온이 뼈 및 치아에 축적될 경우 뼈구조의 기형을 유발한다. 이 때문에 납이온에 대한 높은 주의가 필요하다.

그에 따라 우리는 납이온에 대한 결합 능력이 높은 수용체를 설계 합성하고 납이온과 결합 시 그 complex가 자가조립 하여 nanoparticle을 형성하여 비례 형광 거동을 보일 수 있는 센서를 개발하고자 하였다. 납 이온과 결합하여 aggregation이 발생하는 경우, excimer 형광이 발생하는 형광체를 개발, 센서에 도입하여 센서들을 개발하였다.

합성된 센서들 중 수용액에서 납에 대한 선택성과 민감도가 높은 센서를 대상으로 수질 오염이 된 지하수 및 수돗물에서 납을 검출할 수 있는 형광법을 개발 하였으며 세포에서 납의 침투를 모니터링할 수 있는 센서 또한 개발하여 그 내용을 논문으로 발표하였다. (J. of Hazard. Mater. 2022, 12816) 또한 다양한 형광체와 수용체에 따른 납을 비롯한 금속이온에 대한 센싱 연구를 ACS Appl. Mater. Interfaces에 발표하였다.

3. Ag nanoparticle

은(Ag)과 그 화합물들은 전기 산업, 영상 산업, 제약 산업 등에서 널리 사용된다. 특히 Ag nanoparticle(AgNP)는 박테리아에 대한 강력한 항균 능력과 저렴한 가격으로 인해 널리 사용되고 있다. 따라서 AgNP는 치약, 세제, 페인트, 의류 및 건강 보조 식품 등과 같은 다양한 소비형태로 광범위하게 사용되어져 왔다.

하지만 무분별한 AgNP의 사용으로 인해 수생 환경에 적신호가 켜졌다. 바로 AgNP에서 방출된 Ag+ 이온 때문인데 수생 환경에서 방출된 Ag+은 수생 생물의 DNA 복제를 억제하고 세포질 막을 교란하며 sulfhydryl enzymes 비활성화함으로써 양서류 및 어류에 잠재적인 독성을 나타낸다. 따라서 환경 시스템에서 AgNP 및 Ag+ 을 검출하는 기술이 필요하다.

AgNP 및 Ag+ 을 검출하는 방법으로 형광 probe를 사용할 경우 높은 감도, 저렴한 운용 비용, 세포 내 Ag+ 을 직접 검출할 수 있다는 장점이 있지만 Ag+ 검출 민감도를 높이기 위해 주로 높은 비율에 유기용매를 사용하는 것, Hg2+와 같은 soft metal에 의한 간섭 및 방해 효과, 특히 대부분의 Ag+ 검출 형광 probe의 경우 AgNP 검출에 사용될 수 없다는 명확한 한계점이 존재하였다.

이러한 한계점을 극복하기 위해 aggregation 상태에서 확연한 형광 증가와 형광 변화를 보여주는 aggregation-induced emission (AIE) fluorophore를 도입한 펩타이트 기반의 형광 프로브를 개발하였다. 기존에 개발된 형광 프로브들과는 다르게 AIE fluorophore을 도입한 형광체의 경우 유기 용매를 사용하지 않고 100% 수용액에서 높은 solubility를 보여주었을 뿐만 아니라, 다양한 metal과 Hg2+의 존재 하에서도 AgNP 및 Ag+와 선택적으로 반응하여 535nm 파장에서 높은 형광 증가를 보이는 것을 확인하였다.